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                                    用VIBRA-CELL超聲波細胞破碎儀-破壞和溶解細胞

                                    發布時間:2020-11-14瀏覽量:11490

                                    細胞的破壞是蛋白質組學領域以及細胞內產物的分離和制備中的重要方法。分離亞細胞級分和濃縮蛋白質可以更有效地鑒定和研究目的蛋白質。從研究到生產,生物技術的許多領域,特別是重 組技術,都需要使用超聲波來破壞細胞。細胞破壞的重點是從細胞內獲得所需的產物,必須破壞細胞壁才能進入細胞內。

                                    所有細胞都有質膜,是一種蛋白質-脂質雙層,形成將細胞內容物與細胞外環境分隔開的屏障。構 成質膜的脂質是兩親性的,具有自發締合形成閉合雙分子片的親水和疏水部分。膜蛋白包埋在脂 質雙層中,由跨疏水核心的一個或多個域固定在適當位置。另外,外周蛋白通過與完整的膜蛋白或極性脂頭基團的相互作用而結合雙層的內表面或外表面。脂質和蛋白質含量的性質隨細胞類型而變化。

                                    在動物細胞中,質膜是將細胞內容物與環境分開的唯一屏障,但在植物中,質膜也被剛性細胞壁 包圍。植物細胞壁由多層纖維素組成。這些類型的細胞外屏障賦予細胞形狀和剛性。植物細胞壁 特別堅硬,很難機械或化學破壞。動物細胞中缺乏細胞外壁,使其相對易于裂解。

                                    柔軟,新鮮的植物組織通?梢酝ㄟ^在裂解緩沖液中進行超聲處理來破壞。其他植物組織(例如 松針)需要干燥,沒有液氮。一些堅硬的木質植物材料需要先在液氮中冷凍和研磨,然后再進行 超聲波處理。植物細胞懸浮培養物和愈傷組織可通過在裂解緩沖液中超聲處理30秒至2分鐘來裂 解。植物和植物組織的多樣性使得不可能對所有樣品都給出單一建議。但是,應該意識到,大多 數植物組織通常都含有多糖和多酚,它們可以與RNA共沉淀并抑制下游分析。在進行實際的RNA 分離之前,用聚乙烯吡咯烷酮(PVP)處理植物組織裂解液會從裂解液中沉淀出此類有問題的成分。

                                    單細胞生物(微生物)由圍繞原生質膜和細胞質的半滲透性,堅硬,剛性的外細胞壁組成。細胞質由核酸,蛋白質,碳水化合物,脂質,酶,無機離子,維生素,色素,包涵體和約80%的水組 成。為了從細胞內部分離和提取任何這些物質,有必要破壞細胞壁和原生質膜。在某些情況下, 細胞可能會在沒有幫助的情況下排泄所需的物質,但是在大多數情況下,必須裂解細胞才能釋放 這些細胞內物質。打破細胞膜并釋放內含物提出了重大挑戰。該過程必須快速而徹底,以最大程 度地提高蛋白質產量。由于施加的能量必須足夠大,足以破壞細胞膜或壁,同時又要足夠柔和, 以免對物理或化學造成損害,因此,具有可變強度功能的Sonics Vibra-Cell非常適合此應用。

                                    微生物對超聲分解的敏感性差異很大。例如,最容易崩解的是棒狀形式(桿菌),而球形生物 (球菌)則更具抵抗力。結核病微生物所屬的分枝桿菌屬特別難以破壞。

                                    與動物細胞相比,酵母,革蘭氏陽性細菌以及在較小程度上革蘭氏陰性細菌的細胞壁要硬得多, 并且需要相對較高的功率才能破壞細胞。

                                    細菌極為多樣。因此,很難對所有細菌提出一個建議。超聲波處理將裂解包括分枝桿菌在內的 大多數革蘭氏陽性和陰性細菌。通常,將玻璃珠和裂解液添加到細菌細胞沉淀中,并將樣品超 聲處理幾分鐘。僅通過在裂解液中進行超聲處理就可以裂解某些革蘭氏陰性細菌。細菌細胞壁 可用溶菌酶消化,形成原生質球。與革蘭氏陰性菌相比,革蘭氏陽性菌通常需要更嚴格的消化 作用(增加孵育時間,提高孵育溫度等)。然后用超聲在GITC裂解緩沖液中輕松裂解原生質球。

                                    革蘭氏陰性菌通常需要10至15分鐘的處理時間,而葡萄球菌則需要20至30分鐘的處理時間。

                                    使用Vibra-Cell時,應使用的強度級別取決于應用程序。例如,高強度可能被推薦用于細胞分 裂,但是當細胞內組分的釋放可能令人反感時,例如當細胞分裂時,絕對不應使用。細胞器隔離。

                                    控制探頭尖端的振幅的能力是進行過程優化的前提。而且由于每種應用都需要自己的一組處理 參數,由于體積和成分的變化,最佳振幅只能憑經驗確定。處理新樣品時,建議先將幅度設置 為50%(帶微尖的幅度為30%),然后根據需要增加或減小。

                                    在超聲破碎之前,可以用各種試劑處理細胞以幫助破壞過程。 可以通過將細胞懸浮在低滲緩 沖液中來促進溶解,這會使它們通過物理剪切而更容易腫脹和破裂。 溶菌酶可用于消化酵母 和細菌細胞壁的多糖成分。 或者,可以通過用玻璃珠處理堅韌的細胞來促進細胞壁的破碎, 從而加快加工速度。 這種處理通常用于酵母細胞。 樣品的粘度通常在裂解期間由于核酸材料 的釋放而增加。 可以將DNase加入樣品中(25-50 μg / ml),以減少此問題。 超聲處理的材料 不需要核酸酶處理,因為超聲處理會剪切染色體。 因為每當細胞被操縱時,蛋白水解都會成 為一個問題。 建議在裂解樣品中加入蛋白酶抑制劑。

                                    所有活生物體均含有蛋白水解酶(蛋白酶和肽酶)。多種細胞功能(例如細胞修復或細胞外物 質的消化)都需要蛋白酶。在整個細胞中,蛋白酶活性受到間隔區或抑制劑的嚴格調控,以防 止對細胞蛋白質的破壞。細胞裂解干擾了這種調節,樣品的蛋白水解降解成為一個問題。因此, 經常需要向細胞裂解緩沖液中添加蛋白酶抑制劑。蛋白酶抑制劑是通過與蛋白酶可逆或不可逆 結合而起作用的生物或化學化合物;谏婕半逆I裂解的官能團,蛋白酶通常屬于四個進化上 不同的酶家族之一。因此,通常需要幾種不同類型的抑制劑來保護蛋白質在提取和純化過程中 不被蛋白水解。

                                    細胞破壞是RNA分離的第一步,也是影響分離RNA產量和質量的最關鍵步驟之一。通常,細胞 破壞需要快速而徹底。緩慢的破壞,例如將細胞或組織置于異硫氰酸胍(GITC)裂解液中, 而沒有任何額外的物理剪切,可能會由于內部釋放的內源性RNase而導致RNA降解,但仍然不 能被蛋白質變性劑GITC吸收。當處理內源性RNase高的組織(如脾臟和胰腺)時,這尤其令人 擔憂。不完全破壞也可能導致產量降低,因為樣品中的某些RNA仍被捕獲在完整細胞中,因此 無法用于后續純化。對于大多數樣品,徹底破壞可以通過在破壞之后仔細檢查裂解液來監測。 除破壞含有堅硬,非細胞成分的物質(例如結締組織或骨骼)外,不應有可見的顆粒。

                                    當使用Vibra-Cell處理困難的細胞時,用酶"弱化"細胞壁進行預處理是有益的。酵母經常使用的 酶促方法包括溶菌酶,糖醛酸苷酶,糖苷酶,葡糖醛酸酶,裂解酶,酶解酶和溶葡萄球菌素消 化。溶菌酶,酶解酶和溶葡萄球菌素消化是細菌和酵母經常使用的酶解方法,用于溶解被超聲 波難以剪切的外殼,膠囊,衣殼或其他結構。酶處理后通常在GITC裂解緩沖液中進行超聲處 理。膠原蛋白酶可以與膠原蛋白,溶葡萄球菌素和葡萄球菌一起使用,以及胰蛋白酶透明質酸 酶與肝臟和腎臟一起使用。

                                    酵母極難破壞。在裝有樣品,胍基裂解緩沖液和小玻璃珠(0.5 – 1毫米)的試管中處理酵母聲 波。強烈建議進行上述酶預處理。

                                    要破壞絲狀真菌,請將菌絲體墊刮入冷研缽中,加入液氮,用杵研磨成細粉,然后在裂解緩沖 液中超聲處理,使其完全溶解。由于真菌也可能富含多糖,因此用聚乙烯吡咯烷酮(PVP)進 行預處理可能是有益的。

                                    在土壤和沉積物中發現細胞的破壞是通過以下步驟完成的:1)在RNA分離步驟之前,從材料中 分離細菌細胞。這是通過在機械攪拌器中將濕土壤均質化,然后以低速沉淀細菌細胞來實現的。 從這一點出發,可以如上所述對細菌進行裂解,或者2)直接從土壤或沉積物中分離RNA。例如, 將土壤添加到硅藻土和裂解緩沖液中,然后進行超聲處理。然后將樣品離心以除去固體碎片。

                                    培養的細胞相對容易被Vibra-Cell破壞。通過離心收集懸浮液中生長的細胞,漂洗以除去培養基, 然后通過在GITC裂解緩沖液中超聲處理來裂解。在洗滌和裂解細胞的同時將燒瓶或平板放在冰 上,將進一步保護RNA免受破壞過程中釋放的內源性Rnases的侵害。

                                    洗滌劑細胞裂解有時會與超聲處理結合使用以促進破壞。洗滌劑通過溶解蛋白質并破壞脂質: 脂質,蛋白質:蛋白質和蛋白質:脂質相互作用來破壞細胞周圍的脂質屏障。洗滌劑(如脂質) 會自締合并與疏水表面結合。它們由極性親水性頭基和非極性疏水性尾基組成,并且根據頭部 基團的性質分類為離子性(陽離子或陰離子),非離子性或兩性離子。它們的行為取決于頭組 和尾部的屬性。

                                    使用Vibra-Cell時,應使用的強度級別取決于應用程序。例如,高強度可能被推薦用于細胞分 裂,但是當細胞內組分的釋放可能令人反感時,例如當細胞分裂時,絕對不應使用。細胞器隔離。

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